M = massimo,
m = minimo.

Nota: Per classificare diversamente un olio o dichiararlo non conforme per la purezza è sufficiente che uno solo dei requisiti non rientri nei limiti fissati.
(¹) Limite massimo complessivo per i composti rivelati dal rivelatore a cattura di elettroni. Per i componenti accertati singolarmente il limite massimo è 0,10 mg/kg.
(²) (Delta-5-23-Stigmastadiemolo + Cicrosterolo + Betasitosterolo + Sitostanolo + Delta-5-24 Stigmastodienolo).

10. Il testo dell'allegato IV è sostituito dal testo seguente:

 

DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI CERE MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE
 

1. OGGETTO
Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del contenuto di cere di alcune sostanze grasse, nelle condizioni di prova. Il metodo può essere impiegato in particolare per differenziare l'olio di oliva di pressione da quello di estrazione (olio di sansa).

2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa, addizionata di opportuno standard interno, viene frazionata mediante cromatografia su colonna di gel di silice idratato; la frazione eluita per prima nelle condizioni di prova (avente polarità inferiore a quella dei trigliceridi) viene recuperata e quindi analizzata direttamente mediante gascromatografia in colonna capillare.

3. APPARECCHIATURA
 

3.1. Beuta da 25 ml.

3.2. Colonna in vetro per cromatografia avente diametro interno 15,0 mm e altezza 30-40 cm.

3.3. Gascromatografo adeguato con colonna capillare, dotato di sistema di introduzione diretta in colonna costituito da:

3.3.1. Forno a termostato per le colonne, idoneo a mantenere la temperatura desiderata con la precisione di ± 1 °C.

3.3.2. Iniettore a freddo per introduzione diretta in colonna.

3.3.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore.

3.3.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-amplificatore (3.3.3), con tempo di risposta non superiore a 1 s, e con velocità della carta variabile.

3.3.5. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 10-15 m, diametro interno 0,25-0,32 mm, internamente ricoperta con liquido SE-52 o SE-54 equivalenti, con spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30 µm.

3.4. Microsiringa per on-column da 10 µl con ago cementato.

4. REAGENTI
 

4.1. Gel di silice 70-230 mesh art. 7754 Merck. Il gel di silice è posto in muffola a 500 °C per 4 h. Dopo raffreddamento è addizionato del 2 % di acqua. Si agita bene allo scopo di omogeneizzare la massa. Si conserva al buio almeno per 12 h prima del suo impiego.

4.2. n-Esano, per cromatografia.

4.3. Etere etilico, per cromatografia.

4.4. n-Eptano, per cromatografia.

4.5. Soluzione campione di lauril arachidato, allo 0,1 % (m/v) in esano (standard interno).

4.6. Gas vettore: idrogeno, puro per gascromatografia.

4.7. Gas ausiliari:
- idrogeno, puro per gascromatografia;
- aria, pura per gascromatografia.

5. PROCEDIMENTO
 

5.1. Separazione della frazione delle cere.

5.1.1. Mettere in sospensione 15 g di gel di silice idratato al 2 % in n-esano anidro e introdurli nella colonna. Dopo assestamento spontaneo si completa lo stesso mediante l'uso di un vibratore elettrico per rendere più omogeneo il letto cromatografico. Si percolano 30 ml di n-esano allo scopo di allontanare le eventuali impurezze.

5.1.2. Conduzione della cromatografia su colonna. Nella beuta da 25 ml si pesano esattamente circa 500 mg di campione, si addiziona dell'opportuna quantità di standard interno, in funzione del presunto contenuto di cere. Ad esempio si aggiungono 0,1 mg di lauril arachidato nel caso di olio di oliva e 0,25-0,50 mg nel caso di olio di sansa. Il campione così preparato viene trasferito nella colonna cromatografica preparata come a

5.1.1. aiutandosi con due porzioni da 2 ml cadauna di n-esano. Si lascia fluire il solvente fino ad un battente di 1 mm. A questo punto inizia l'eluizione cromatografica raccogliendo 140 ml di miscela n-esano/etere-etilico nel rapporto 99: 1, rispettando un flusso di circa 15 gocce ogni 10 s (2,1 ml/min). La frazione così ottenuta viene evaporata mediante evaporatore rotante sino quasi a secchezza, si allontanano gli ultimi 2 o 3 ml con l'aiuto di un debole flusso di azoto e si riprende il tutto con 10 ml di n-eptano.

5.2. Analisi gascromatografica.

5.2.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna.

5.2.1.1. Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di ingresso connesso col sistema on column, e il terminale di uscita al rivelatore. Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore e del sistema di registrazione, ecc.).

5.2.1.2. Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere al suo condizionamento. Si fa fluire un leggero flusso di gas attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso gascromatografico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una temperatura di almeno 20 °C superiore a quella di esercizio (nota). Si mantiene tale temperatura per almeno 2 h, quindi si porta il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei gas, accensione della fiamma, collegamento con il registratore elettronico, regolazione della temperatura della camera per la colonna, del rivelatore, ecc.) e si registra il segnale ad una sensibilità almeno 2 volte superiore a quella prevista per l'esecuzione dell'analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva. Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna.
Nota: La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere inferiore di almeno 20 °C alla temperatura massima prevista per il liquido di ripartizione impiegato.

5.2.2. Scelta delle condizioni operative.

5.2.2.1. Condizioni operative di massima sono le seguenti:
- temperatura della colonna: inizio a 80 °C, quindi incremento di 30 °C/min fino a 120 °C, poi programmata di 5 °C/min fino a 340 °C;
- temperatura del rilevatore: 350 °C;
- velocità lineare del gas di trasporto: idrogeno 20-35 cm/s;
- sensibilità strumentale: da 4 a 16 volte l'attenuazione minima;
- sensibilità di registrazione: 1-2 mV fondo scala;
- velocità della carta: 30 cm/h;
- quantità di sostanza iniettata: 0,5-1 µl di soluzione.
Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo (in modo da ottenere cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti: il tempo di ritenzione dello standard interno C32 deve essere 25 ± 2 min e il picco delle cere più rappresentativo deve essere contenuto tra il 60 e il 100 % fondo scala).

5.2.2.2. I parametri di integrazione dei picchi dovranno essere impostati in modo da ottenere una corretta valutazione delle aree dei picchi che vengono presi in considerazione.

5.2.3. Esecuzione dell'analisi.

5.2.3.1. Con la microsiringa da 10 µl si preleva 1 µl di soluzione; si alza lo stantuffo della siringa in modo che l'ago sia vuoto. Si introduce l'ago attraverso il dispositivo di iniezione e dopo 1-2 s si inietta rapidamente e si estrae quindi lentamente l'ago dopo circa 5 s.

5.2.3.2. Si effettua la registrazione fino a completa eluizione delle cere. La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti (5.2.1.2).

5.2.4. Identificazione dei picchi L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e per paragone con miscele di cere a tempi di ritenzione noti, analizzate nelle medesime condizioni. Nella fig. 1 è riportato un cromatogramma delle cere di un olio di oliva vergine.

5.2.5. Valutazione quantitativa.

5.2.5.1. Si procede al calcolo con l'integratore delle aree dei picchi dello standard interno e degli esteri alifatici da C40 a C46.

5.2.5.2. Si calcola il contenuto di ogni singolo estere, in mg/kg di sostanza grassa come segue:

singolo estere (mg/kg) = (Ax . ms . 100) / (As . m )

dove:
Ax = area del picco del singolo estere;
As = area del picco del lauril arachidato;
ms = massa di lauril arachidato aggiunta, in milligrammi;
m = massa di campione prelevato per la determinazione, in grammi.

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Si riportano i contenuti delle singole cere, e la loro somma in mg/kg di sostanza grassa.

 

Determinazione della velocità lineare del gas Nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano 1-3 µl di metano (o propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a percorrere la colonna, dal momento dell'iniezione al momento dell'uscita del picco (tM). La velocità lineare in cm/s è data da L/tM in cui L è la lunghezza della colonna in centimetri e tM è il tempo cronometrato in s.

 

11. Nell'allegato V, punto 4.11, la percentuale "5 %" è sostituita dalla percentuale "2 %".

12. Nell'allegato V, punto 5.1.1, primo comma, sono soppressi i termini "di oli di semi o".

13. Nell'allegato V, punto 5.1.1, secondo comma, sono soppressi i termini "e grassi animali o vegetali".

14. Nell'allegato V, punto 5.1.1, sono aggiunti, alla fine, i termini seguenti: "oppure utilizzare betulinolo al posto del colesterolo"

15. Nell'allegato V, punto 5.4.5.2, i termini "in millimetri quadrati" sono soppressi.

16. Nell'allegato VI, punto 6, i termini "in millimetri quadrati" sono soppressi.

17. Nell'allegato IX, il testo del punto 3.4 è sostituito dal testo seguente:
"3.4. Colonna per cromatografia con una parte superiore avente lunghezza di 270 mm e diametro di 35 mm e una parte inferiore avente lunghezza di 270 mm e diametro di 10 mm."

18. Nell'allegato IX, punto 4.1, il secondo trattino è soppresso.

19. Nell'allegato XIII, il titolo "Prova della raffinazione" è sostituito dal titolo "Neutralizzazione e decolorazione dell'olio d'oliva in laboratorio".

20. Il testo dell'allegato XIV è sostituito dal testo seguente.

 

NOTE COMPLEMENTARI 2, 3 E 4 DEL CAPITOLO 15 DELLA NOMENCLATURA COMBINATA
 

2. A. Rientrano nei codici NC 1509 e 1510 soltanto gli oli provenienti esclusivamente dal trattamento delle olive e le cui caratteristiche analitiche relative ai tenori in steroli e in acidi grassi sono quelle di seguito riportate: