LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità europea,
visto il regolamento n. 136/66/CEE del Consiglio, del 22 settembre 1966, relativo all'attuazione di un'organizzazione comune dei mercati nel settore dei grassi (1), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 3179/93 (2), in particolare l'articolo 35 bis,
visto il regolamento (CEE) n. 2658/87 del Consiglio, del 23 luglio 1987, relativo alla nomenclatura tariffaria e statistica ed alla tariffa doganale comune (3), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 3330/94 della Commissione (4), in particolare l'articolo 9,
considerando che il regolamento (CEE) n. 2568/91 della Commissione (5), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 2632/94 (6), ha definito le caratteristiche degli oli d'oliva e degli oli di sansa d'oliva, nonché i relativi metodi di analisi; che il regolamento (CEE) n. 2568/91 ha inoltre modificato le note complementari 2, 3 e 4 del capitolo 15 della nomenclatura combinata figurante nell'allegato I del regolamento (CEE) n. 2568/87;
considerando che, tenendo conto degli sviluppi compiuti dalla ricerca, si ravvisa l'opportunità di adattare le caratteristiche degli oli d'oliva definite dal regolamento (CEE) n. 2568/91, in modo da offrire maggiori garanzie di purezza dei prodotti commercializzati, nonché di indicare il relativo metodo di analisi;
considerando che alla luce dell'esperienza acquisita appaiono necessari alcuni adattamenti del metodo di determinazione della trinoleina; che d'altro canto, per proseguire l'armonizzazione con le norme internazionali del Consiglio oleicolo internazionale, è opportuno adattare alcuni valori massimi relativi alle caratteristiche degli oli d'oliva e degli oli di sansa d'oliva;
considerando che le modifiche delle caratteristiche degli oli d'oliva considerati richiedono una modifica delle note complementari 2, 3 e 4 del capitolo 15 della nomenclatura combinata;
considerando che, per consentire l'adattamento alle nuove norme e l'adozione dei mezzi necessari per la loro applicazione e per prevenire inoltre perturbazioni negli scambi commerciali, è opportuno differire di due mesi circa l'entrata in vigore del presente regolamento e permettere, per un periodo limitato, lo smaltimento dell'olio condizionato prima della sua entrata in vigore;
considerando che è quindi necessario modificare il regolamento (CEE) n. 2658/87 ed il regolamento (CEE) n. 2568/91, il cui allegato XIV ha modificato dette note complementari;
considerando che le misure previste dal presente regolamento sono conformi al parere del comitato di gestione per i grassi,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:
Articolo 1

Il regolamento (CEE) n. 2568/91 è modificato come segue:
1) all'articolo 2 è aggiunto il seguente trattino:
" - per la determinazione degli stigmastadieni, il metodo figurante nell'allegato XVII. ";
2) gli allegati sono modificati conformemente all'allegato del presente regolamento.
 

Articolo 2

Il testo delle note complementari 2, 3 e 4 del capitolo 15 della nomenclatura combinata contenuta nell'allegato I del regolamento (CEE) n. 2658/87 è sostituito dal testo contenuto nell'allegato II del presente regolamento.
 

Articolo 3

Il presente regolamento entra in vigore il sessantesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.
Esso non si applica agli oli d'oliva e di sansa d'oliva condizionati prima della sua entrata in vigore e commercializzati fino al termine del secondo mese ad essa successivo.
Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.
Fatto a Bruxelles, il 28 marzo 1995.

Per la Commissione
Franz FISCHLER
Membro della Commissione

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(1) GU 172 del 30. 9. 1966, pag. 3025/66.
(2) GU L 285 del 20. 11. 1993, pag. 9.
(3) GU L 256 del 7. 9. 1987, pag. 1.
(4) GU L 350 del 31. 12. 1994, pag. 51.
(5) GU L 248 del 5. 9. 1991, pag. 1.
(6) GU L 280 del 29. 10. 1994, pag. 43.
 

ALLEGATO I

1. Al sommario degli allegati del regolamento (CEE) n. 2568/91 è aggiunto il seguente titolo:
" Allegato XVII: Metodo di determinazione degli stigmastadieni negli oli vegetali ".
2. Il testo dell'allegato I è sostituito dal seguente:
 

 ALLEGATO I
CARATTERISTICHE DEGLI OLI D'OLIVA

M = massimo, m = minimo.
(1) Limite massimo complessivo per i composti rivelati dal rivelatore a cattura di elettroni
Per i componenti accertati singolarmente il limite massimo è 0,10 mg/kg.
(2) Somma di isomeri che (non) potrebbero essere separata mediante colonna capillare.
(3) (Delta-5-23-Stigmastadienolo + Clerosterolo + Sitosterolo + Sitostanolo + Delta-5-Avenosterolo + Delta-5-24 Stigmastodienolo).
Nota:
Un olio deve essere rifiutato se qualcuna delle caratteristiche non rientra nei limiti fissati.

= Massimo, m = minimo
Nota:
Un olio deve essere rifiutato se qualcuna delle caratteristiche che rientra nei limiti fissati.
Ai fini della constatazione della purezza, qualora il K270 superi il limite della categoria corrispondente, si deve procedere alla determinazione del K270 dopo il passaggio su allumina."
3. Nell'allegato VIII, il testo della nota 5 è sostituito dal seguente:
" Nota 5:
Per gli oli vergini lampanti e per gli oli di sansa d'oliva greggi, al fine di ottenere una buona separazione del picco della trilinoleina da quelli adiacenti o di eventuali sostanze interferenti, è necessario purificare preventivamente gli oli conformemente alla metodologia seguente:
si fanno assorbire 200 ml di olio, senza diluirli, su una colonnina di silice per estrazione liquido-solido (tipo SEP PAK silica cartridge-waters part. n. 51900).
I trigliceridi vengono eluiti con 20 ml di esano anidro per HPLC in un tempo massimo di 20 sec.
Il prodotto eluito viene essiccato in corrente d'azoto e ripreso in isopropanolo o acetone (5 ml). Si iniettano 10-20 ml in HPLC. È necessario controllare che la composizione di acidi grassi dell'olio sia la stessa prima e dopo la purificazione nei limiti di errore del metodo analitico adottato. ".
4. È aggiunto il seguente allegato XVII:



" ALLEGATO XVII:
METODO DI DETERMINAZIONE DEGLI STIGMASTADIENI NEGLI OLI VEGETALI

1. SCOPO
Determinazione degli stigmastadieni negli oli vegetali contenenti basse concentrazioni di questi idrocarburi, soprattutto oli d'oliva vergini e oli di sansa d'oliva grezzi.

2. OGGETTO
Il metodo può essere applicato a tutti gli oli vegetali, ma è attendibile soltanto se il tenore di questi idrocarburi è compreso tra 0,01 e 4,0 mg/kg. Esso è particolarmente adatto a rivelare la presenza di oli vegetali raffinati (oliva, sansa, girasole, palma, ecc.) nell'olio di oliva vergine, dato che gli oli raffinati contengono stigmastadieni, mentre gli oli vergini non li contengono.

3. PRINCIPIO
Isolamento dell'insaponificabile. Separazione della frazione costituita dagli steroidi a carattere di idrocarburi mediante cromatografia su colonna di gel di silice e analisi mediante gascromatografia su capillare.

4. APPARECCHIATURA
4.1. Palloni idonei da 250 ml, con condensatore a riflusso.
4.2. Imbuti separatori da 500 ml.
4.3. Palloni a fondo rotondo da 100 ml.
4.4. Evaporatore rotante.
4.5. Colonna per cromatografia in vetro (1,5-2,0 cm di diametro interno, della lunghezza di 50 cm) provvista di rubinetto in teflon e di tappo in fibra di lana di vetro o disco di vetro sinterizzato all'estremità inferiore. Per preparare la colonna di gel di silice versare l'esano nella colonna cromatografica fino a raggiungere uno spessore di circa 5 cm e riempire quindi con un impasto di gel di silice in esano (15 g in 40 ml) aiutandosi con porzioni di esano. Lasciar depositare completando poi il deposito con leggere vibrazioni. Aggiungere solfato di sodio anidro fino all'ottenimento di uno spessore di circa 0,5 cm ed infine eluire l'esano in eccesso.
4.6. Gascromatografo provvisto di rilevatore a ionizzazione di fiamma, iniettore a separazione o a freddo, lungo la colonna e stufa programmabile con l'approssimazione di ± 1 °C.
4.7. Colonna capillare di silice fusa per gascromatografia (0,25 o 0,30 mm di diametro interno, della lunghezza di 25 m) ricoperte di fase di fenilmetilsilicone al 5 %, spessore 0,25 mm.
Nota 1.
Possono essere usate altre colonne di polarità equivalente o inferiore.
4.8. Registratore-integratore con possibilità d'integrazione da valle a valle.
4.9. Microsiringa per gascromatografia da 5-10 ml con ago cementato.
4.10. Camicia di riscaldamento o piastra termica, elettrica.

5. REAGENTI
Tutti i reagenti debbono essere puri per analisi se non specificato diversamente. L'acqua usata dev'essere distillata oppure di purezza per lo meno equivalente.
5.1. Esano o miscela di alcani con intervallo di ebollizione a 65-70 °C, distillato su colonna di rettificazione.
Nota 2.
Il solvente dev'essere distillato in modo da eliminare le impurezze.
5.2. Etanolo al 96 % v/v.
5.3. Solfato di sodio anidro.
5.4. Soluzione alcolica di idrossido di potassio al 10 %. Aggiungere 10 ml d'acqua a 50 g di idrossido di potassio, agitare e sciogliere quindi la miscela in etanolo fino a 500 ml.
Nota 3.
La potassa alcolica vira al bruno se lasciata riposare. Dev'essere preparata di fresco ogni giorno e tenuta in bottiglie di vetro scure ben tappate.
5.5. Gel di silice 60 per cromatografia su colonna 70-230 mesh (Merck, ref. 7734 o simili).
Nota 4.
Di regola il gel di silice può essere usato prelevandolo direttamente dal contenitore senza alcun trattamento preliminare. Tuttavia alcune partite di silice sono scarsamente attive e determinano separazioni cromatografiche di cattiva qualità. In casi del genere, il gel di silice dev'essere disattivato scaldandolo per almeno quattro ore a 550 °C; successivamente, sistemarlo in un essiccatore fino a raffreddamento e trasferirlo quindi in un pallone provvisto di tappo. Aggiungere il 2 % di acqua e agitare fino a scomparsa dei grumi e libero flusso della polvere. Il gel di silice dev'essere trattato come sopra se le partite di gel di silice danno cromatogrammi con picchi di interferenza. Come alternativa, può essere usato gel di silice 60 extra puro (Merck, ref. 7754).
5.6. Soluzione madre (200 ppm) di colesta-3,5-diene (Sigma, purezza 99 %) in esano (10 mg in 50 ml).
5.7. Soluzione standard di colesta-3,5-diene in esano alla concentrazione di 20 ppm, ottenuta diluendo la soluzione di cui sopra.
Nota 5.
Le soluzioni 5.6 e 5.7 non si deteriorano per almeno 4 mesi se conservate a una temperatura inferiore ai 4 °C.
5.8. Soluzione di n-nonacosano in esano ad una concentrazione di circa 100 ppm.
5.9. Gas vettore per cromatografia: idrogeno o elio puro al 99,9990 %.
5.10. Gas ausiliari per il rivelatore a ionizzazione di fiamma: idrogeno puro al 99,9990 % ed aria purificata.

6. PROCEDIMENTO
6.1. Preparazione dell'insaponificabile:
6.1.1. Pesare 20 g, con l'approssimazione di ± 0,1 di olio in un pallone da 250 ml (4.1), aggiungere 1 ml della soluzione standard di colesta-3,5-diene (20mg) e 75 ml di potassa alcolica al 10 %, preparare il condensatore a riflusso e portare a leggera ebollizione per 30 minuti. Allontanare il pallone contenente il campione dalla fonte di calore e lasciare raffreddare leggermente la soluzione (non far raffreddare completamente, altrimenti il campione si depositerebbe). Aggiungere 100 ml d'acqua e trasferire la soluzione in un imbuto a decantazione (4.2) con l'ausilio di 100 ml di esano. Agitare la miscela vigorosamente per 30 secondi e lasciar stratificare.
Nota 6.
Se si forma un'emulsione che non scompare rapidamente, aggiungere piccoli quantitativi di etanolo.
6.1.2. Trasferire la fase acquosa inferiore in un secondo imbuto separatore ed estrarre nuovamente con 100 ml di esano. Eliminare ancora la fase inferiore e lavare gli estratti di esano (raccolti in un altro imbuto separatore) tre volte con tre porzioni, di 100 ml ciascuna, di una miscela etanolo-acqua (1: 1) fino a raggiungimento di pH neutro.
6.1.3. Far passare la soluzione di esano attraverso del solfato di sodio anidro (50 g), lavare con 20 ml di esano a far evaporare in evaporatore rotante a 30 °C e bassa pressione fino a secchezza.
6.2. Separazione della frazione di idrocarburo steroidico:
6.2.1. Trasferire il residuo nella colonna di frazionamento con l'ausilio di due porzioni di esano da 1 ml, far passare il campione attraverso la colonna lasciando che la soluzione scenda fino alla sommità del solfato di sodio e avviare l'eluizione cromatografica con esano ad una velocità di efflusso di 1 ml/min. circa. Eliminare i primi 25-30 ml dell'eluizione e raccogliere quindi la rimanente frazione di 40 ml. Dopo averla raccolta, trasferirla in un pallone a fondo rotondo da 100 ml (4.3).
Nota 7.
La prima frazione contiene idrocarburi saturi (figura 1a), la seconda quelli steroidici. Continuando l'eluizione si ottiene squalene e composti connessi. Ai fini di una buona separazione tra idrocarburi saturi e steroidici, è necessario ottimalizzare le frazioni di volume. A questo scopo il volume della prima frazione dev'essere regolato in modo che, quando viene analizzata la seconda frazione, i picchi che rappresentano gli idrocarburi saturi siano bassi (vedasi figura 1c); se essi non compaiono, ma l'intensità del picco standard è bassa, il volume dev'essere ridotto. In ogni caso non è necessaria una separazione completa dei componenti della prima e seconda frazione, dato che durante l'analisi gascromatografica non vi è sovrapposizione di picchi, se detta analisi viene eseguita nelle condizioni precisate al paragrafo 6.3.1. In generale non è necessaria l'ottimalizzazione della seconda frazione in volume, data la buona separazione degli altri componenti. Tuttavia la presenza di una grosso picco per un tempo di ritenzione inferiore di circa 1,5 minuti rispetto allo standard è dovuta allo squalene e sta ad indicare una cattiva separazione.
6.2.2. Evaporare la seconda frazione in un evaporatore a 30 °C e bassa pressione fino a secchezza e sciogliere immediatamente il residuo in 0,2 ml di esano. Conservare la soluzione in frigorifero fino all'analisi.
Nota 8.
I residui 6.1.3 e 6.2.2 non devono essere lasciati asciugare, né tenuti a temperatura ambiente. Non appena essi vengono ottenuti, è necessario aggiungere il solvente e conservare le soluzioni in frigorifero.
6.3. Gascromatografia:
6.3.1. Condizioni operative per l'iniezione a separazione:
- Temperatura dell'iniettore: 300 °C.
- Temperatura del rivelatore: 320 °C.
- Registratore-integratore: i parametri di integrazione devono essere fissati in modo che forniscano una corretta valutazione delle aree. Si raccomanda un'integrazione da valle a valle.
- Sensibilità: circa 16 volte l'attenuazione minima.
- Quantitativo di soluzione iniettato: 1ml.
- Temperature di programmazione della stufa: inizialmente 235 °C per 6 min. e successivamente aumento di 2 °C/min. fino a 285 °C.
- Iniettore provvisto di separatore di flusso a 1: 15.
- Vettore: elio o idrogeno a una pressione di circa 120 kPa.
Queste condizioni possono essere adeguate alle caratteristiche del cromatografo e della colonna in modo da ottenere cromatogrammi che rispettino i seguenti requisiti: picco dello standard interno entro 5 min. circa dei tempi definiti al paragrafo 6.3.2; detto picco dev'essere pari ad almeno l'80 % della scala completa.
Il sistema gascromatografico deve essere verificato iniettando una miscela della soluzione madre di colestadiene (5.6) con la soluzione di n-nonacosano (5.8). Il picco del colesta-3,5-diene deve comparire prima di quello dell'n-nonacosano (figura 1c); se ciò non succede, si hanno due possibilità: abbassare la temperatura della stufa e/o usare una colonna meno polare.
6.3.2. Identificazione del picco Il picco dello standard interno compare dopo circa 19 min. e lo stigmasta-3,5-diene, a un tempo di ritenzione relativo di circa 1,29 (cfr. figura 1b). Lo stigma-3,5-diene è associato a piccoli quantitativi di un isomero e di solito entrambi danno origine a un unico picco cromatografico. Tuttavia, se la colonna è troppo polare oppure mostra un forte potere risolvente, l'isomero può comparire sotto forma di piccolo picco prima e accanto a quello dello stigmasta-3,5-diene (Figura 2). Per essere certi che gli stigmastadieni vengano eluiti in un picco unico, è consigliabile sostituire la colonna con una meno polare oppure con una di diametro interno superiore.
Nota 9.
Gli stigmastadieni di riferimento possono essere ottenuti dall'analisi di un olio vegetale raffinato usando un quantitativo inferiore di campione ( 1-2 g). Gli stigmastadieni danno un picco significativo e facilmente identificabile.
6.3.3. Analisi quantitativa Il tenore di stigmastadieni viene determinato con la formula seguente:

mg/kg di stigmastadieni = (As * Mc) / (Ac * Mo)

dove:
As = area del picco dello stigmastadiene (se il picco è ripartito in due isomeri, somma delle aree dei 2 picchi).
Ac = area dello standard interno (colestadiene)
Mc = massa di standard aggiunto, in microgrammi
Mo = massa di olio prelevata, in grammi
Limite di rivelazione: circa 0,01 mg/kg ".

Figura 1
Gascromatogrammi ottenuti da campioni di olio d'oliva analizzati su colonna capillare di silice fusa (0,25 mm di diametro interno, della lunghezza di 25 m) ricoperti di fenilmetilsilicone al 5 %, con uno spessore 0,25 mm.

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a) Prima frazione (30 ml) di olio vergine, addizionata intenzionalmente con lo standard.
b) Seconda frazione (40 ml) di olio d'oliva contenente 0,10 mg/kg di stigmastadieni.
c) Seconda frazione (40 ml) contenente una piccola proporzione della prima frazione.

Figura 2
Gascromatogramma ottenuto da un campione di olio di oliva raffinato analizzato su colonna DB-5 che mostra l'isomero dello stigmasta-3,5-diene.



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ALLEGATO II

" 2. A. Rientrano nelle voci 1509 e 1510 soltanto gli oli provenienti esclusivamente dal trattamento delle olive e le cui caratteristiche analitiche relative ai tenori in steroli e in acidi grassi sono quelle di seguito riportate:

Tabella I
Tenore in acidi grassi in % degli acidi grassi totali

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