|
1. OGGETTO
Il presente metodo dà un orientamento
generale per l'applicazione della
gascromatografia, con l'uso di colonne a
riempimento o capillari, per determinare
la composizione qualitativa e
quantitativa di una miscela di esteri
metilici degli acidi grassi ottenuta in
conformità con il metodo specificato
nell'allegato
Xb. Il metodo non è applicabile agli
acidi grassi polimerizzati.
2. REAGENTI
|
2.1. Gas
vettore
Gas inerte (azoto, elio, argo, idrogeno, ecc.)
completamente essiccato ed
avente un tenore di ossigeno
inferiore a 10 mg/kg.
Nota 1: L'idrogeno, che viene
usato come gas vettore soltanto
con colonne
capillari, può raddoppiare la
velocità dell'analisi, ma è
pericoloso; sono
disponibili dispositivi di
sicurezza.
2.2. Gas
ausiliari
2.2.1. Idrogeno (purezza >99,9
%), esente da impurezze organiche.
2.2.2. Aria od ossigeno,
esente da impurezze organiche.
2.3.
Standard di riferimento
Miscela di esteri metilici di acidi grassi puri
oppure esteri metilici di un
grasso a
composizione nota, di preferenza
analogo a quello della sostanza
grassa da
analizzare. Sarà necessario
l'ossidazione degli acidi grassi
poliinsaturi. |
3. APPARECCHIATURA
Le istruzioni precisano che deve essere
usata la consueta apparecchiatura per
gascromatografia, facendo uso di colonne
a riempimento e/o capillari nonché di un
rivelatore a ionizzazione di fiamma. È
consigliabile usare apparecchiatura in
grado di garantire l'efficienza e la
risoluzione specificate al punto 4.1.2.
|
3.1.
Gascromatografo
Il gascromatografo deve
comprendere i seguenti elementi.
|
3.1.1.
Sistema ad iniezione
|
Usare un sistema ad
iniezione:
a) con colonne a
riempimento, aventi lo
spazio morto minore
possibile (in questo
caso ilsistema di
iniezione deve poter
essere riscaldato a
una temperatura di
20-50°C superiore a
quella della colonna)
oppure
b) con colonne
capillari, nel qual
caso il sistema di
iniezione deve essere
appositamente
progettato. Esso può
essere del tipo a
separazione oppure del
tipo non a separazione
sull'iniettore della
colonna.
Nota 2: In
assenza di acidi
grassi aventi meno di
16 atomi di carbonio,
può essere usatoun
iniettore ad ago
mobile. |
3.1.2.
Stufa
|
La
stufa deve essere atta
a scaldare la colonna
ad almeno 260°C e a
mantenere la
temperatura desiderata
con l'approssimazione
di 1°C per la colonna
a riempimento e con
l'approssimazione di
0,1°C per la colonna
capillare. Quest'ultimo
requisito è
particolarmente
importante se si usa
una provetta di silice
fusa. Il ricorso al
riscaldamento
programmato è
raccomandato in tutti
i casi e in
particolare per gli
acidi grassi aventi
meno di 16 atomi di
carbonio. |
3.1.3. Colonna e
riempimento
|
3.1.3.1. Colonna
costruita in materiale
inerte alle sostanze
da analizzare
|
(cioè vetro o
acciaio
inossidabile) e
avente le
seguenti
dimensioni:
a) lunghezza:
1-3 m. Se sono
presenti acidi
grassi a catena
lunga (oltre
C20) dovrà
essere usata una
colonna
relativamente
corta. Se invece
si analizzano
acidi a 4-6
atomi di
carbonio, si
raccomanda di
usare una
colonna avente
una lunghezza di
2 m.
b) diametro
interno: da 2 a
4 mm.
Nota 3:
Se sono presenti
componenti
poliinsaturi
aventi più di
tre legami
doppi, essi
potranno essere
decomposti in
una colonna di
acciaio
inossidabile.
Nota 4:
Può essere usato
u n sistema di
colonne a
riempimento
gemelle. |
3.1.3.2.
Riempimento,
comprendente i
seguenti elementi:
|
a) supporto:
terra di
diatomee lavata
con acido e
silanizzata,
oppure altro
idoneo supporto
inerte con una
gamma ristretta
di granulometria
(compresa tra
125 e 200 µm,
con variazioni
di ħ 25 µm); la
granulometria
media è
correlata al
diametro interno
e alla lunghezza
della colonna;
b) fase
stazionaria:
tipo di
poliestere di
liquido polare
(ad es.
polisuccinato di
dietilenglicole,
polisuccinato di
butandiolo,
poliadipato di
etilenglicole
ecc.),
cianosiliconi o
qualsiasi altro
liquido che
consenta la
separazione
cromatografica
richiesta (vedi
clausola 5). La
fase stazionaria
deve essere
compresa tra il
5 % (m/m) e il
20 % (m/m) del
riempimento. Per
alcune
separazioni può
essere usata una
fase stazionaria
non polare. |
3.1.3.3.
Condizionamento della
colonna
|
Con la colonna
staccata, dalla
parte del
rivelatore,
scaldare
gradualmente la
stufa a 185°C e
far passare una
corrente di gas
inerte
attraverso la
colonna di
recente
preparata ad un
flusso compreso
tra 20 ml/min e
60 ml/min per
almeno 16 h a
questa
temperatura e
per ulteriori 2
h a 195°C |
. |
3.1.4. Colonna
capillare
|
3.1.4.1. Tubo
costituito di
materiale inerte alle
sostanze da analizzare
(di
|
solito vetro o
silice fusa). Il
diametro interno
deve essere
compreso tra 0,2
mm e 0,8 mm. La
superficie
interna deve
esser sottoposta
a un opportuno
trattamento (ad
es. preparazione
della
superficie,
inattivazione)
prima di essere
ricoperto con la
fase
stazionaria.
Nella maggior
parte dei casi è
sufficiente una
lunghezza di 25
mm. |
3.1.4.2.
Fase stazionaria, di
solito del tipo
poliglicole [poli(etilenglicole)
|
20 000],
poliestere (polisuccinato
di butandiolo)
oppure
polisilossano
polare (cianosiliconi).
Sono adatte le
colonne legate (cross-linked).
Nota 5:
Vi è il rischio
che i
polisilossani
polari creino
difficoltà
nell'identificazione
e separazione
dell'acido
linolenico e
degli acidi a
C20. Le
coperture devono
essere sottili,
ad esempio 0,1
µm-0,2 µm. |
3.1.4.3.
Montaggio e
condizionamento della
colonna
|
Osservare le
normali
precauzioni
necessarie per
il montaggio
delle colonne
capillari,
ovvero
sistemazione
della colonna
nella stufa
(supporto),
scelta e
collegamento di
giunti (a tenuta
stagna),
sistemazione
delle estremità
della colonna
nell'iniettore e
nel rivelatore
(riduzione degli
spazi morti).
Sottoporre la
colonna ad un
flusso di gas
vettore [ad es.
0,3 bar (30 kPa)
per una colonna
avente una
lunghezza di 25
mm e un diametro
interno di 0,3
mm].
Condizionare la
colonna
programmando la
temperatura
della stufa a
3°C/min dalla
temperatura
ambiente a una
temperatura di
10°C inferiore
al limite di
decomposizione
della fase
stazionaria.
Mantenere la
stufa a questa
temperatura per
1 h fino a
stabilizzazione
della linea di
base. Riportarla
a 180°C in modo
da lavorare in
condizioni di
isotermicità.
Nota 6:
Sono disponibili
in commercio
opportune
colonne
precondizionate.
|
|
3.1.5.
Rivelatore, di
preferenza idoneo ad
essere riscaldato a
una
temperatura
superiore a quella
della colonna.
|
|
|
3.2.
Siringa
La siringa deve avere una capacità
massima di 10 µl ed essere
graduata in divisioni di 0,1 µl.
3.3.
Registratore
|
Se la
curva di registrazione deve
essere usata per calcolare
la composizione della
miscela analizzata, è
necessario un registratore
elettronico di alta
precisione compatibile con
l'apparecchiatura usata.
Detto registratore deve
avere le seguenti
caratteristiche:
a) tasso di risposta, al di
sotto di 1,5 s, di
preferenza 1 s (il tasso di
risposta è il periodo
necessario affinché la punta
di registrazione passi dallo
0 % al 90 % a seguito
dell'introduzione improvvisa
di un segnale del 100 %);
b) ampiezza della carta,
minimo 20 cm;
c) velocità della carta,
adattabile a valori compresi
tra 0,4 cm/min e 2,5 cm/min.
|
3.4.
Integratore o calcolatore
(facoltativo)
|
Un
calcolo rapido ed accurato
può essere effettuato con
l'ausilio di un integratore
o calcolatore elettronico.
Quest'ultimo deve dare una
risposta lineare con una
sensibilità adeguata e la
correzione della deviazione
della linea di base deve
essere soddisfacente. |
|
4. PROCEDIMENTO
Nelle operazioni descritte dal paragrafo
4.1 al paragrafo 4.3 si fa accenno
all'uso di un rivelatore a ionizzazione
di fiamma. Come alternativa può essere
usato un gascromatografo munito di
catarometro (che funziona in base al
principio della variazione di
conducibilità termica). Le condizioni di
funzionamento vengono pertanto
modificate come descritto nella clausola
6.
|
4.1.
Condizioni dell'analisi
|
4.1.1.
Selezione delle condizioni operative
ottimali
|
4.1.1.1.
Colonna a riempimento
Nella scelta delle condizioni per
effettuare la prova, devono essere
prese in considerazione le
seguenti varianti:
a) la lunghezza ed il diametro
della colonna;
b) la natura e la quantità della
fase stazionaria;
c) la temperatura della colonna;
d) il flusso di gas vettore;
e) la risoluzione necessaria;
f) le dimensioni del campione da
analizzare, scelto in modo che il
collegamento tra il rivelatore e
l'elettrometro diano una risposta
lineare;
g) la durata dell'analisi.
In linea di massima i valori
riportati nella tabella 1 e nella
tabella 2 danno i risultati
auspicati, cioè almeno 2 000
piatti teorici per metro di
lunghezza della colonna per quanto
si riferisce allo stearato di
metile, e l'eluizione dello stesso
entro 15 minuti circa. Se
l'apparecchiatura lo consente,
l'iniettore deve trovarsi a una
temperatura di circa 200°C ed il
rivelatore a una temperatura pari
o superiore a quella della
colonna. Di norma, il rapporto tra
il flusso dell'idrogeno fornito al
rilevatore a ionizzatore di fiamma
e quello del gas vettore varia tra
1:2 e 1:1 in funzione del diametro
della colonna. Il flusso
dell'ossigeno è di circa 5-10
volte quello dell'idrogeno. |
|
|
Tabella 1
|
Diametro
interno della colonna mm |
Flusso del
gas vettore ml/min |
|
2 |
da 15 a 25 |
|
3 |
da 20 a 40 |
|
4 |
da 40 a 60 |
Tabella 2
|
Concentrazione della fase
stazionaria % (m/m) |
Temperatura
della colonna °C |
|
5 |
175 |
|
10 |
180 |
|
15 |
185 |
|
20 |
185 |
|
4.1.1.2.
Colonna capillare
Le caratteristiche di efficienza e
di permeabilità delle colonne
capillari indicano che la
separazione tra i costituenti e la
durata dell'analisi sono
ampiamente dipendenti dal flusso
del gas vettore nella colonna. È
pertanto necessario ottimizzare le
condizioni operative influenzando
questo parametro (o più
semplicemente la pressione di
testa della colonna), a seconda
che si desideri migliorare le
separazioni o effettuare
un'analisi rapida. |
|
4.1.2.
Determinazione del numero di piatti
teorici (efficacia) e risoluzione
(vedi
figura 1)
Effettuare l'analisi di una miscela
di stearato di metile e di oleato di
metile in proporzioni più o meno
equivalenti (ad es. esteri metilici
del burro di cacao). Scegliere la
temperatura della colonna e il
flusso di gas vettore in modo che il
massimo del picco dello stearato di
metile venga registrato circa 15
minuti dopo il picco del solvente.
Usare un quantitativo sufficiente
della miscela di esteri metilici in
modo che il picco dello stearato di
metile occupi circa tre quarti della
scala intera. Calcolare il numero
dei piatti teorici, n (efficienza),
con la formula:
n = 16 {[dr
(I) H] / [W (I)]}²
e la risoluzione
R usando la formula:
R = 2D / [W(I)
+ W (II)]
dove:
dr (I) = è la distanza di
ritenzione, in millimetri,
dall'inizio del cromatogramma fino
al massimo del picco dello stearato
di metile;
W(I) e W(II) = sono le ampiezze, in
millimetri, del picchi
rispettivamente dello stearato di
metile e dell'oleato di metile,
misurati tra i punti d'intersezione
delle tangenti ai punti di
inflessione della curva con la linea
di base;
D = è la distanza, in millimetri,
tra i picchi massimi dello stearato
di metile e dell'oleato di metile.
|
|
|
|
Figura 1
Cromatogramma per la
determinazione del numero di
piatti teorici
(efficienza) e risoluzione
|
Le condizioni operative da scegliere
sono quelle idonee ad almeno 2 000
piatti teorici per metro di
lunghezza della colonna per quanto
si riferisce allo stearato di metile
e una risoluzione di almeno 1,25.
|
4.2.
Sostanza da analizzare
|
Usando la siringa (3.2) prendere 0,1
µl-2 µl della soluzione di esteri
metilici preparata conformemente all'allegato
Xb e iniettarli nella colonna. Nel
caso di esteri non in soluzione,
preparare una soluzione di circa 100
mg/ml in eptano di qualità
cromatografica ed iniettare da 0,1 µl
a 1 µl di questa soluzione. Se
l'analisi riguarda costituenti
presenti soltanto in tracce, la
quantità di sostanza da analizzare può
essere aumentata (fino a 10 volte). |
4.3. Analisi
|
Di norma le condizioni operative sono
quelle di cui al paragrafo 4.1.1. È
possibile tuttavia operare a una
temperatura inferiore della colonna
quando si tratta di determinare acidi
grassi aventi meno di 12 atomi di
carbonio oppure a una temperatura più
elevata quando si tratta di
determinare acidi grassi con oltre 20
atomi di carbonio. All'occasione, è
possibile programmare la temperatura
in entrambi questi casi. Ad esempio,
se il campione contiene gli esteri
metilici degli acidi grassi con meno
di 12 atomi di carbonio, iniettare il
campione a 100°C (oppure da 50°C a
60°C se è presente acido butirrico) e
raggiungere immediatamente la
temperatura a un tasso compreso tra
4°C/min e 8°C/min in condizioni
ottimali. In taluni casi possono
essere associati i due procedimenti.
Dopo il riscaldamento programmato,
continuare l'eluizione a temperatura
costante finché tutti i componenti
sono stati eluiti. Se lo strumento non
prevede il riscaldamento programmato,
usarlo a due temperature fisse
comprese tra 100°C e 195°C. Se
necessario, si raccomanda di
effettuare un'analisi su due fasi
fisse a polarità differente per
verificare l'assenza di picchi
mascherati, ad esempio nel caso della
presenza contemporanea di C18:3 e
C20:0 oppure C18:3 e C18:2 associati.
|
4.4.
Preparazione del cromatogramma di
riferimento e dei grafici di
riferimento.
|
Analizzare la miscela standard di
riferimento (2.3) nelle stesse
condizioni operative di quelle usate
per il campione e misurare i tempi di
ritenzione o le distanze di ritenzione
per gli acidi grassi costituenti. Su
carta semilogaritmica, per qualsiasi
grado di insaturazione, costruire i
grafici che mostrano il logaritmo del
tempo o della distanza di ritenzione
in funzione del numero di atomi di
carbonio. In condizioni isotermiche, i
grafici relativi ad acidi a catena
lineare aventi lo stesso grado di
insaturazione devono essere linee
rette. Queste linee devono essere
all'incirca parallele. È necessario
evitare condizioni in cui si possano
verificare i "picchi mascherati",
ovvero nei quali la risoluzione è
insufficiente a separare due
costituenti. |
|
5. ESPRESSIONE DEI
RISULTATI
|
5.1. Analisi
qualitativa
Identificare i picchi dell'estere
metilico del campione dai grafici
preparati al
paragrafo 4.4, se
necessario per interpolazione. 5.2. Analisi
quantitativa
|
5.2.1.
Determinazione della composizione
|
A
parte casi
eccezionali, usare il
metodo di
normalizzazione
interno, cioè
presumere che la
totalità dei
componenti del
campione siano
rappresentati sul
cromatogramma, in modo
che il totale delle
aree sotto i picchi
costituisca il 100 %
dei costituenti (eluizione
totale). Se
nell'apparecchiatura è
previsto un
integratore, usare i
dati da esso ottenuti.
In caso negativo,
determinare l'area
sotto ciascun picco
moltiplicando
l'altezza del picco
per l'ampiezza a metà
altezza e, se
necessario, prendere
in considerazione le
varie attenuazioni
usate durante la
registrazione. |
5.2.2.
Metodo di calcolo
|
5.2.2.1.
Caso generale
|
Calcolare il contenuto di un dato
componente I, espresso come
percentuale in massa degli esteri
metilici, determinando la
percentuale rappresentata
dall'area del picco corrispondente
relativa alla somma delle aree di
tutti i picchi, usando la formula
seguente:
(ċ A / Ai) *
100
dove:
Ai = è l'area sotto il picco
corrispondente al componente i;
ċ A = è la somma delle aree sotto
tutti i picchi.
Esprimere il risultato con
l'approssimazione di una decimale.
Nota 7: In questo caso
generale, si ritiene che il
risultato del calcolo basato sulle
aree relative rappresenti una
percentuale in massa. Per i casi
nei quali questa asserzione non è
giustificata, vedi 5.2.2.2. |
5.2.2.2.
Uso dei fattori di correzione
|
In taluni casi, ad esempio in
presenza di acidi grassi aventi
meno di 8 atomi di carbonio oppure
di acidi aventi gruppi secondari,
quando si usano rivelatori di
conduttività termica oppure quando
è necessario il grado più elevato
di accuratezza, devono essere
usati fattori di correzione che
convertano le percentuali delle
aree e dei picchi in percentuali
in peso dei componenti.
Determinare i fattori di
correzione con l'ausilio di un
cromatogramma derivato
dall'analisi di una miscela di
riferimento di esteri metilici di
composizione nota, effettuata in
condizioni operative identiche a
quelle usate per il campione. Per
questa miscela di riferimento, la
percentuale in peso del componente
i è data dalla formula:
(mi / ċ m) *
100
dove:
mi = è il peso del componente i
nella miscela di riferimento;
ċ m = è il totale delle masse dei
vari componenti della miscela di
riferimento.
Dal cromatogramma della miscela di
riferimento (4.4) calcolare la
percentuale (area/area) del
componente i come segue:
(Ai / ċ A) *
100
dove:
Ai è l'area sotto il picco
corrispondente al componente i,
ċ A è la somma delle aree sotto
tutti i picchi.
Il fattore di correzione viene
quindi calcolato come segue:
Ki = (mi * ċ
A) / (Ai * ċ m)
Di norma i
fattori di correzione vengono
espressi facendo riferimento a
KC16 sicché i fattori relativi
diventano:
K'i = (Ki /
KC 1 6)
Per il campione
il contenuto di ciascun componente
espresso come percentuale in degli
esteri metilici è:
(K'i * Ai) /
[ċ (K' i * Ai)] * 100
Esprimere i
risultati con l'approssimazione di
una decimale. |
5.2.2.3.
Uso di uno standard interno
|
In alcune analisi (ad es. quando
non tutti gli acidi grassi sono
quantificati, ad esempio quando
sono presenti acidi con 4 e 6
atomi di carbonio accanto ad acidi
con 16 e 18 atomi di carbonio,
oppure quando è necessario
determinare il quantitativo
assoluto di un acido grasso in un
campione) è necessario ricorrere
ad uno standard interno. Vengono
spesso usati acidi grassi con 5,15
o 17 atomi di carbonio. Deve
essere determinato l'eventuale
fattore di correzione per lo
standard interno. La percentuale
in peso del componente i, espressa
come esteri metilici, è data dalla
formula:
(ms * K'i *
Ai) / (m * K's * As) * 100
dove:
Ai è l'area sotto il picco
corrispondente al componente i;
As è l'area sotto il picco
corrispondente allo standard
interno;
K'i è il fattore di correzione per
il componente i (relativo a KC 1
6);
K's è il fattore di correzione
dello standard interno (relativo a
KC 1 6);
m è il peso, in milligrammi, della
sostanza da analizzare;
ms è il peso, in milligrammi,
dello standard interno.
Esprimere i risultati con
l'approssimazione di una decimale. |
|
|
|
6. CASO SPECIALE -
USO DI UN CATAROMETRO (FUNZIONANTE IN
BASE AL PRINCIPIO DEI MUTAMENTI DI
CONDUTTIVITÀ TERMICA)
Per la determinazione della composizione
qualitativa e quantitativa di una
miscela di esteri metilici degli acidi
grassi può essere usato altresì un
gascromatografo associato a un
rivelatore funzionante in base al
principio dei mutamenti di conduttività
termica (catarometro). Se quest'ultimo
viene usato, le condizioni specificate
alle clausole 3 e 4 devono essere
modificate come indicato nella tabella
3. Per l'analisi quantitativa, usare i
fattori di correzione definiti al
paragrafo 5.2.2.2.
Tabella 3
|
Variabile |
Valore/condizioni |
|
Colonna |
Lunghezza: da 2 m
a 4 m
Diametro interno: 4 mm |
|
Supporto |
Granulometria
compresa tra 160 µm e 200 µm |
|
Concentrazione
della fase stazionaria |
Dal 15 % (m/m) al
25 % (m/m) |
|
Gas vettore |
Elio oppure, in
mancanza di quest'ultimo, idrogeno,
col tenore più basso possibile di
ossigeno |
|
Gas ausiliari |
Nessuno |
|
Temperatura
dell'iniettore |
Da 40°C a 60°C al
di sopra di quella della colonna |
|
Temperatura della
colonna |
Da 180°C a 200°C |
|
Flusso del gas
vettore |
Di norma tra 60
ed 80 ml/min |
|
Entità del
campione di sostanza iniettato |
Di norma tra 0,5
µl e 2µl |
7. RELAZIONE SULLA PROVA
La relazione sulla prova deve
specificare i metodi usati per la
preparazione degli esteri metilici e per
l'analisi gascromatografica nonché i
risultati tenuti. Essa deve citare
altresì tutti i dettagli operativi non
specificati nella presente norma
internazionale oppure considerati come
facoltativi, nonché i particolari di
qualsiasi evento che possa avere
influenzato i risultati. La relazione
sulla prova deve comprendere tutti i
dati necessari per la completa
identificazione del campione.
|
