3.1. Matraccio da 250 ml, munito di refrigerante a ricadere con giunti a smeriglio.

3.2. Imbuti separatori da 500 ml.

3.3. Matracci da 250 ml.

3.4. Attrezzatura completa per analisi cromatografica su strato sottile, per lastre

       di vetro 20 * 20 cm.

3.5. Lampada a luce ultravioletta, con lunghezza d'onda 366 o 254 nm.

3.6. Microsiringhe da 100 µl e 500 µl.

3.7. Imbuto cilindrico filtrante a setto poroso G 3 (porosità 15-40 µm) di diametro

       circa 2 cm e altezza circa 5 cm, con attacco idoneo per filtrazione sotto

       vuoto e giunto smerigliato maschio 12/21.

3.8. Beuta per vuoto da 50 ml con giunto femmina smerigliato 12/21 adattabile

       all'imbuto filtrante (3.7.).

3.9. Provetta da 10 ml a fondo conico con tappo a tenuta.

3.10. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato

       di sistema di splittaggio, costituito da:

3.10.1. Camera termostatica per le colonne, idonea a mantenere la temperatura

       desiderata con la precisione di ± 1°C.

3.10.2. Complesso di vaporizzazione termoregolabile con elemento vaporizzante in

       vetro persilanizzato.

3.10.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore.

3.10.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-

       amplificatore (3.10.3.), con tempo di risposta non superiore a 1 secondo e 

       con velocità della carta variabile.

3.11. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 20 + 30 m, diametro interno

       0,25 + 0,32 mm, internamente ricoperta con liquido SE-52 o SE-54 o

       equivalenti, con spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30 µm.

3.12. Microsiringa per gascromatografia da 10 µl con ago cementato.

4.1. Potassio idrossido, soluzione etanolica circa 2 N: si sciolgono, sotto raffreddamento, 130 g di idrossido di potassio (titolo minimo 85 %) in 200 ml di acqua distillata, quindi si porta ad 1 litro con etanolo. La soluzione si conserva in bottiglie di vetro scuro ben tappate.
4.2. Etere etilico, puro per analisi.
4.3. Sodio solfato anidro, puro per analisi.
4.4. Lastre di vetro stratificate con gel di silice, senza indicatore di fluorescenza, 

       spessore 0,25 mm (sono reperibili in commercio già pronte per l'uso).
4.5. Potassio idrossido, soluzione etanolica 0,2 N: si sciolgono 13 g di idrossido di

       potassio in 20 ml di acqua distillata e si porta a 1 litro con etanolo.
4.6. Benzene, per cromatografia (vedi 5.2.2).
4.7. Acetone, per cromatografia (vedi 5.2.2).
4.8. Esano, per cromatografia (vedi 5.2.2).
4.9. Etere etilico, per cromatografia.
4.10. Cloroformio, puro per analisi.
4.11. Soluzione di riferimento per la cromatografia su placca: colesterolo o

       fitosteroli, soluzione al 5 % in cloroformio.
4.12. 2,7-Diclorofluoresceina, soluzione etanolica allo 0,2 %. Si rende

      leggermente basica aggiungendo qualche goccia di soluzione alcolica 2 N di 

      idrossido di potassio.
4.13. Piridina anidra, per cromatografia.
4.14. Esametildisilazano.
4.15. Trimetilclorosilano.
4.16. Soluzioni campione di trimetilsilileteri degli steroli: si preparano al momento

        dell'impiego partendo da steroli puri o da miscele di steroli ottenute da oli

        che li contengano.
4.17. a-colestanolo, soluzione allo 0,2 % (m/V) in cloroformio (standard interno).
4.18. Gas vettore: idrogeno o elio, puri per gascromatografia.
4.19. Gas ausiliari:
        - idrogeno, puro per gascromatografia
        - aria, pura per gascromatografia.

5.1. Preparazione dell'insaponificabile.

5.1.1. Nel matraccio da 250 ml si introduce, impiegano la microsiringa da 500 µl, 

5.1.2. Si aggiungono 50 ml di soluzione etanolica di idrossido di potassio 2 N, si

5.1.3. Si travasa il contenuto del matraccio quantitativamente, in un imbuto

 5.1.4. Si riuniscono gli estratti eterei in un unico imbuto separatore e si lavano

 5.1.5. Si distilla l'etere fino a pochi ml, quindi si porta a secco sotto leggero vuoto

5.2. Separazione della frazione sterolica.

5.2.1. Preparazione delle lastre basiche: si immergono le lastre al gel di silice

 5.2.2. Nella camera di sviluppo delle lastre si introduce una miscela benzene-

5.2.3. Si prepara una soluzione al 5 % circa di insaponificabile (5.1.5.) in

5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto in 5.2.2.

5.2.5. Si spruzza la placca debolmente ed uniformemente con la soluzione di 2,7-

 5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nell'area

5.3. Preparazione dei trimetilsilileteri.

5.3.1. Nella provetta contenente la frazione sterolica si aggiunge il reattivo per la

5.3.2. Si tappa la provetta, si agita cautamente (senza capovolgere) fino a

5.4. Analisi gascromatografica.

5.4.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna.
5.4.1.1. Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di

5.4.1.2. Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere

5.4.2. Scelta delle condizioni operative.

5.4.2.1. Condizioni operative di massima sono le seguenti:

5.4.3. Esecuzione dell'analisi.

5.4.3.1. Con la microsiringa da 10 µl si preleva 1 ml di esano, si aspirano 0,5 µl di

5.4.3.2. Si effettua la registrazione fino a completa eluizione dei TMSE degli

5.4.4. Identificazione dei picchi.

5.4.5. Valutazione quantitativa.

5.4.5.1. Si procede al calcolo con l'integratore, delle aree dei picchi dell'a-

5.4.5.2. Si calcola il contenuto di ogni singolo sterolo, in mg/100 g di sostanza

6.1 Si riportano i contenuti dei singoli steroli, in mg/100 g di sostanza grassa e, come steroli totali, la loro somma.

6.2 Si calcola il contenuto percentuale di ogni singolo sterolo dal rapporto fra l'area del picco corrispondente e la sommatoria delle aree dei picchi degli steroli.
 

% Dello sterolo x = (AX / å A) * 100

in cui:
AX = Area del picco X,
å A = Sommatoria delle aree di tutti i picchi.