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1.
OGGETTO
Il metodo descrive il
procedimento per la
determinazione dell'eritrodiolo
nelle sostanze grasse.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa viene
saponificata con idrossido
di potassio in soluzione
etanolica, quindi si
estrae l'insaponificabile
con etere etilico e lo si
purifica per passaggio su
colonna di allumina. Si
procede al frazionamento
dell'insaponificabile
mediante cromatografia su
strato sottile su placca
di gel di silice e si
isolano la banda della
frazione sterolica e
quella dell'eritrodiolo.
Gli steroli e l'eritrodiolo,
recuperati dalla placca
vengono trasformati in
trimetilsilileteri, la
miscela è quindi
analizzata mediante
gascromatografia. Il
risultato è espresso in
percento di eritrodiolo
rispetto all'insieme
eritrodiolo + steroli.
3. APPARECCHIATURA
3.1.
Apparecchiature prescritte
nel metodo all'allegato
V (Determinazione del
contenuto degli steroli).
4.
REAGENTI
4.1.
Reagenti prescritti nel
metodo all'allegato
V (determinazione del
contenuto degli
steroli).
4.2.
Soluzione di riferimento
di eritrodiolo, allo 0,5 %
in cloroformio.
5.
PROCEDIMENTO
5.1.
Preparazione dell'insaponificabile.
Si procede come descritto al paragrafo
5.1.2. del metodo all'allegato
V.
5.2.
Separazione dell'eritrodiolo
e degli steroli.
5.2.1. Vedi paragrafo
5.2.1. del metodo all'allegato
V.
5.2.2. Vedi paragrafo
5.2.2. del metodo all'allegato
V.
5.2.3. Si prepara una
soluzione al 5 % in
cloroformio dell'insaponificabile.
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Con la microsiringa
da 0,1 ml, si
depositano su una
placca
cromatografica, a
circa 1,5 cm dal
bordo inferiore, 0,3
ml di detta
soluzione, in
striscia il più
possibile sottile ed
uniforme. Ad una
estremità della
placca si
depositano, come
riferimento, alcuni
microlitri delle
soluzioni di
colesterolo e di
eritrodiolo. |
5.2.4. Si pone la
placca nella camera di
sviluppo preparata come
detto al paragrafo
|
5.2.1. La
temperatura ambiente
deve essere di circa
20°C. Si chiude
subito col coperchio
e si eluisce fino a
che il fronte del
solvente sia
arrivato a circa 1
cm dal bordo
superiore della
placca. Si rimuove
la placca dalla
camera di sviluppo e
si evapora il
solvente in corrente
di aria calda. |
5.2.5.
Si spruzza la placca
uniformemente con la
soluzione alcolica di 2',
7' -
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diclorofluoresceina.
Esaminando la placca
alla luce
ultravioletta si
individuano le bande
degli steroli e
dell'eritrodiolo in
base
all'allineamento con
i riferimenti, e si
delimitano con una
punta leggermente al
di fuori dei margini
di fluorescenza.
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5.2.6. Con una spatola
metallica si raschia il
gel di silice compreso
nelle aree delimitate. Il
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materiale asportato
dalla placca viene
riunito in bevuta da
50 ml; si aggiungono
15 ml di cloroformio
caldo, si agita bene
e si filtra
sull'imbuto a setto
poroso trasferendo
il gel di silice sul
filtro stesso. Si
lava per tre volte
con porzioni di 10
ml di cloroformio
caldo per volta,
raccogliendo il
filtrato in
palloncino da 100
ml. Si evapora fino
ad un volume di 4-5
ml, si trasferisce
in provetta da
centrifuga a fondo
conico da 10 ml
previamente tarata,
si porta a secco con
blando riscaldamento
in corrente di azoto
e si pesa. |
5.3.
Preparazione dei
trimetilsilileteri.
Si procede come descritto al paragrafo 5.3
del metodo all'allegato
V.
5.4.
Analisi gascromatografica.
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Si procede come
descritto al
paragrafo 5.4 del
suddetto metodo. Le
condizioni operative
dell'analisi
gascromatografica
devono essere tali
che, oltre a
soddisfare i
requisiti richiesti
per l'analisi degli
steroli, portino
anche alla
separazione dei TMSE
dell'eritrodiolo e
dell'uvaolo.
Iniettato il
campione si lascia
svolgere la carta
fino a che siano
stati eluiti gli
steroli presenti, l'eritrodiolo
e l'uvaolo; si
identificano quindi
i picchi (l'eritrodiolo
e l'uvaolo hanno
tempi di ritenzione
relativi, rispetto
al b-sitosterolo, di
circa 1,45 e 1,55
rispettivamente) e
se ne calcolano le
aree come detto per
gli steroli. |
6.
ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Eritrodiolo, % = (A1 + A2)
/ (A1 + A2 + å Asteroli) *
100 in cui:
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A1 = area del picco
dell'eritrodiolo, in
mm²,
A2 = area del picco
dell'uvaolo, in mm²,
å Asteroli = somma
delle aree degli
steroli presenti, in
mm².
Il risultato si
esprime con una
cifra decimale. |
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